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第一作者：林濱城太阳成集团tyc234cc

通訊作者：馬金星教授太阳成集团tyc234cc

第一單位：太阳成集团tyc234cc

論文DOI：10.1016/j.watres.2025.123326

圖文摘要

論文簡介

近日，我院馬金星教授課題組在環境領域知名學術期刊Water Research上發表了題為“Stratified biofilm structure of MABR enabling efficient ammonia removal from aquaculture medicated bath wastewater”的研究論文。

水産養殖過程需要使用抗生素來治療或預防寄生蟲和細菌感染。治療方式主要包括将抗生素作為輔助劑加入飼料中或使用藥浴。當養殖生物表現出與疾病相關的厭食症狀時，藥浴可能是唯一有效的治療手段。然而，水産養殖藥浴廢水中殘留的高濃度抗生素對傳統生物脫氮工藝提出了挑戰。本研究以低能耗、具有生物分層結構特征的膜曝氣生物膜反應器（MABR）為研究對象，考察多生态位功能菌群協同處理水産養殖藥浴廢水的效果。實驗結果表明，即使在高濃度土黴素（OTC）脅迫條件下，MABR仍可實現98.2±1.8%的氨氮（NH₄⁺-N）高效去除，該性能歸因于生物膜對内層功能菌群（如氨氧化菌AOB與亞硝酸鹽氧化菌NOB）的保護作用。硝化過程相關的基因（amoA/B和nxrA）表達整體呈上調趨勢，外排泵激活機制協同形成微生物應激響應。然而，盡管Denitratisoma oestradiolicum（14.5%）和反硝化細菌克隆NOA-1-C（41.7%）顯著富集，但總氮（TN）去除效率從95.3±2.5%降至76.0±8.8%，這可能是由于narG基因表達受限所緻。終止OTC投加并調整運行參數後，總氮去除率恢複至87.4±5.8%。本研究結果展示了MABR技術在水産養殖藥浴廢水處理中的有效性和适應性。

圖文導讀

經170天長期運行後，MABR系統展現出優異的污染物去除性能（圖1a-c）。在15 mg L⁻¹ OTC長期脅迫條件下，系統通過分層生物膜結構維持NH₄⁺-N去除率達98.2±1.8%（圖1a），而TN去除率從初始95.3%下降至76.0%（圖1c），表明反硝化過程受到抑制。通過調控曝氣壓至7±1 kPa後，成功構建缺氧微環境（DO=0.6 mg L⁻¹，圖1d），促使TN去除率恢複至87.4±5.8%。值得注意的是，主體溶液DO水平的降低未顯著影響生物膜内層AOB活性，這突顯了分層生物膜的獨特優勢，有力證實了MABR系統中同步硝化反硝化的有效性。

圖1：MABR系統170天運行性能。（a）氨氮、（b）COD及（c）總氮濃度與去除率；（d）溶解氧（DO）、（e）土黴素濃度與去除效率及（f）進/出水pH值。注：進/出水濃度對應左軸，去除率（Re）對應右軸。

CLSM三維成像顯示，OTC暴露15天後蛋白質、多糖及脂質産量較未暴露組顯著增加（圖2b3），表明微生物通過快速合成胞外聚合物（EPS）建立防禦機制。伴随EPS的累積，生物膜厚度由初始1.14 mm增至1.70 mm（圖2b1-2），驗證了結構強化與抗逆性提升的關聯性。持續暴露至脅迫後期，生物膜厚度趨于穩定（圖2c1-2）且代謝活性維持動态平衡，說明微生物群落已形成新的穩态。值得注意的是，此時多糖含量顯著降低而脂質占比升高（圖2c3），這種EPS組分比例的重分配現象，可能反映了微生物從急性應激（依賴多糖類物質快速成膜）向慢性适應（增強脂質介導的膜穩定性）的代謝策略轉變。

圖2：MABR運行過程中生物膜生長與組分動态可視化。（a1-a3）成熟生物膜，（b1-b3）OTC暴露15天，（c1-c3）OTC暴露35天，（d1-d3）修複期及（e1-e3）氣壓調節後的生物膜活/死細胞活性染色及蛋白質、多糖、脂質分布。注：活/死細胞染色：a1-e1示活細胞（綠色熒光），a2-e2示死細胞（紅色熒光）。組分染色：a3-e3中蛋白質、多糖、脂質分别以綠色、紅色、靛藍顯色。

微生物多樣性分析揭示OTC暴露35天的生物膜分區響應特征：内層菌群豐度波動幅度小于5%，而外層拟杆菌綱（Bacteroidia）相對豐度較S6階段提升2.6倍，同時γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）豐度下降至原水平的48.8%。這種空間分異現象表明，拟杆菌綱可能通過外膜修飾等機制獲得OTC抗性，而作為關鍵反硝化功能菌的γ-變形菌綱衰減，或直接導緻系統TN去除率下降（圖1c）。在物種水平上，内層樣本S7中Denitratisoma oestradiolicum豐度增長2.83倍，而外層S8該菌種占比飙升至70.9%，暗示生物膜通過空間功能菌群重組維持脫氮能力。LEfSe分析進一步确認脅迫組功能菌的顯著富集（LDA>3，p<0.01）。

通過高通量定量PCR（HT-qPCR）揭示生物膜内氮循環功能基因的分層表達特征。氨單加氧酶基因（amoA/B）在内層的拷貝數密度較外層高43%（圖3a），這解釋了系統在長期脅迫下仍維持98.2±1.8%的NH₄⁺-N去除率的現象（圖1a）。亞硝酸鹽氧化基因（nxrA）表達量顯著增加，導緻中間産物NO₂⁻-N被快速轉化為NO₃⁻-N（檢測濃度<0.5 mg L⁻¹）。短期脅迫下nirS1/2及nirK1-3拷貝數激增，支撐系統出水的低NO₂⁻-N水平（圖3c），厭氧氨氧化基因（hzsB）在内層富集，推測生物膜内局部微缺氧區形成，這促進了Anammox的性能發揮（圖3d）。停止脅迫并調控曝氣後，硝酸鹽還原酶基因（narG）基因表達回升（圖3b），驅動MABR反硝化性能恢複，印證功能基因動态對工藝調控的響應機制。

圖3：基于高通量qPCR基因芯片測序的微生物群落中元素氮循環基因的演化。負責（a）氨和亞硝酸鹽氮氧化，（b）硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮還原，（c）亞硝酸鹽氮轉化為一氧化氮，（d）反硝化過程中一氧化二氮轉化的功能基因；（e）上調和下調N循環途徑的示意圖；（f）高OTC脅迫對MABR中N循環影響。注：S1：接種污泥；S2：成熟生物膜（階段I）；S3：階段II内層生物膜；S4：階段II外層生物膜；S5：OTC暴露15天（階段III）内層；S6：OTC暴露15天外層；S7：OTC暴露35天（階段III）内層；S8：OTC暴露35天外層；S9：修複期（階段IV）内層；S10：修複期外層；S11：氣壓調節後（階段V）内層；S12：氣壓調節後外層。在圖e中，所有樣品中注釋的基因用紅色表示，而未成功注釋的基因用黑色表示；在圖f中，AOB：氨氧化細菌，NOB：亞硝酸鹽氧化細菌，DB：反硝化細菌，AnAB：厭氧氨氧化細菌。

KEGG代謝通路分析顯示（圖4），硝化作用相關代謝通路（如K10944–K10946和K10535）在抗生素脅迫下未呈現顯著差異，證實高濃度抗生素對MABR内硝化過程的代謝通路水平影響微弱。與此相反，反硝化相關通路（K00370、K02567、K00368、K15864、K04561及K00376）在抗生素脅迫下發生顯著改變，宏基因組分析結果與qPCR基因芯片定量數據具有良好一緻性（圖4）。

圖4：使用宏基因組分析對MABR系統氮代謝途徑在OTC應激下的KEGG直系同源性（KO）。垂直比例尺表示KEGG KO注釋的标準化豐度。注：條形圖（0.00–1.00）表示KEGG相關數字的相對豐度。藍色色調表示相對豐度較低，而紅色色調表示相對豐度較高。

基于CARD數據庫的注釋分析揭示，OTC脅迫誘導抗生素抗性基因（ARGs）發生顯著空間重組（圖5）。β-内酰胺酶類抗性基因在内外層呈現差異化表達，可能與生物膜内菌群間抗性基因水平轉移（HGT）引發的共抗性效應相關（圖5a）。OTC暴露初期（S5-S6階段），外層菌群因直接接觸高濃度OTC（15 mg L⁻¹），其外排泵基因豐度顯著高于内層（圖5b），表明空間暴露梯度驅動主動外排防禦策略。持續脅迫至S7-S8階段，外層菌群外排泵豐度出現下降且低于内層，推測其防禦能力已達外排防禦阈值。停用OTC後（S9-S10），外排泵基因豐度整體下降，經曝氣壓優化（S11-S12階段）最終恢複至脅迫前水平。多元抗性機制分析表明（圖5c），系統通過三重防禦機制緩解OTC毒性：①靶點修飾；②酶解失活；③膜通透性調控協同降低抗生素攝入。

圖5：抗性基因的演化。（a）不同類别和（b）外排泵基因的相對豐度；（c）基于綜合抗生素抗性數據庫（CARD）的不同時期抗性機制弦圖。注：S1-S12與圖3中描述的一緻；在圖b中，A：抗性結瘤細胞分裂（RND）抗生素外排泵，B：ATP結合盒（ABC）抗生素外排泵，C：主要促進劑超家族（MFS）抗生素外排泵。

小結與展望

本研究通過評估MABR長期運行中分層生物膜結構對水産養殖藥浴廢水的脫氮效果。實驗表明：高濃度OTC暴露可導緻生物膜活性降低及EPS組分顯著重構。硝化過程受抑效應微弱（NH₄⁺-N去除率持續>93.2%），而反硝化性能顯著受損（TN平均去除率降至76.0±8.8%），其機制主要源于生物膜外層反硝化功能基因（narG、nirK、nosZ1、nosZ2）拷貝數整體下調。該代謝異質性可解釋反硝化菌（如Denitratisoma oestradiolicum、反硝化富集菌NOA-1-C）豐度增加與脫氮效率下降的表觀矛盾。研究證實，外排泵協同激活是微生物響應OTC脅迫的重要策略，且通過運行參數優化（如曝氣壓調控）可使TN去除率恢複至87.4±5.8%。綜上，MABR系統在處理含抗生素廢水時展現出高效脫氮能力與顯著過程韌性。

緻謝：本研究得到國家自然科學基金基礎科學中心項目（52388101）、廣東省引進創新創業團隊計劃和廣東省傑出青年科學基金的資助。